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年10月28号德国科学家SvenjaZielke等人在Autophagy杂志上发表题为“ATF4linksERstresswithreticulophagyinglioblastomacells”的论文，研究发现ATF4是LOP诱导的内质网应激和自噬、RETREG1和TEX介导的内质网自噬及自噬性细胞死亡(Autophagiccelldeath,ACD)的新关键调节因子,以及抗腹泻药物LOP（loperamide，洛哌丁胺）诱导胶质母细胞瘤细胞死亡。
一、研究背景
内质网是真核细胞蛋白质合成、折叠、组装、加工及包装的主要场所。当细胞受到内外因素的刺激时，内质网形态、功能发生改变，蛋白质加工运输受阻，内质网内累积大量未折叠或错误折叠的蛋白质，会刺激分子伴侣表达增加，向功能失调蛋白募集，来辅助蛋白质正确折叠。在生理条件下，HSPA5/Bip，分子伴侣热休克蛋白家族Hsp70成员5，与ER传感器蛋白EIF2AK3/PERK，ERN1/IRE1α和ATF6结合，使其处于失活状态。当发生内质网应激/未折叠蛋白质反应时，HSPA5聚集到未折叠的蛋白上触发EIF2AK3、ERN1和ATF6的激活，并通过不同的信号级联降低整体蛋白的合成。活化的EIF2AK3、ERN1及ATF6又会促进下游因子表达，因此其下游的这些因子也常用作为内质网应激标记蛋白，如ATF4、CHOP、XBP1。ATF4是一种转录因子，激活主要控制自噬、蛋白质折叠、氨基酸代谢、氧化还原平衡和凋亡的基因。内质网应激会刺激内质网膜会扩增或重组，以确保蛋白质的正确折叠。为了维持细胞的稳态，细胞将通过一定途径使内质网保持原来的形状和大小，如内质网自噬（reticulophagy），即选择性降解内质网的自噬过程。
现有的研究表明，在reticulophagy过程中，一些ER膜蛋白，如FAMB/RETREG1、RTN3、TEX和ATL3，可以通过LC3/GABARAP相互作用区域(LIRs/GIMs)充当特异性受体，招募自噬相关蛋白。尽管已经确定了不少内质网自噬相关的受体，但由于不同受体所处位置及所需的激发条件又不尽相同。目前对诱导发生的内质网自噬的确切机制仍知之甚少。
LOP（loperamide，洛哌丁胺）为长效抗腹泻药，临床上主要治疗各种病因引起的急慢性腹泻，特别适于慢性腹泻的长期治疗。作者先前的实验曾报导称LOP能够诱导胶质母细胞瘤的自噬性死亡。而有报道称在细胞发生自噬性死亡之前其内质网应激水平升高，为此作者想探究LOP处理诱导的胶质母细胞瘤的细胞自噬性死亡，是否由内质网应激水平增加所导致的。
二、研究内容
（1）LOP诱导胶质母细胞瘤细胞（GBM）和小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)内质网应激和自噬
作者观察了在LOP处理下胶质母细胞瘤细胞（下文除特殊说明外，所使用细胞均为胶质母细胞瘤细胞）内几种内质网应激标记蛋白的表达水平。
Thapsi（thapsigargin，*胡萝卜素）是一种钙离子转运抑制剂，内质网应激的诱导化合物，为阳性对照。由上图我们可以看到LOP处理后内质网应激标记蛋白XBP1明显增加，初步说明LOP可以诱发了胶质母细胞瘤的内质网应激。
为了进一步验证上述结论，作者分别在胶质母细胞瘤细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中进行实验。结果显示在LOP时间梯度处理下，ATF4、P-EIF2A、DDIT3和HSPA5的表达水平与阳性对照一致，均明显上升，进一步说明LOP能够诱发内质网应激。同时作者发现内质网应激标记蛋白ATF4经LOP处理后到达峰值的时间要早于自噬标记蛋白LC3B和GABARAP；在ATG7和ATG5敲除之后，内质网应激依旧存在，说明内质网应激不是发生在自噬之后。综上表明LOP确实诱发了内质网应激而且早于LOP诱发的自噬。
（2）ATF4对于lop触发的自噬和ACD至关重要
转录调控因子ATF4调控多个自噬相关的基因的表达，LOP诱发自噬所是否依赖ATF4？
作者构建了ATF4KO细胞系。从A图可以看到，相比对照而言，在敲除ATF4之后，经LOP时间梯度处理的细胞中，LC3和GABARAP表达水平降低，说明LOP诱发自噬需要ATF4。D图显示，在加药处理48h后，通过PI（碘化丙啶）染核发现ATF4敲除细胞的死亡率较野生型明显降低,说明ATF4是LOP诱发细胞死亡所必需的；ATG7/ATF4双敲除细胞比ATG7单敲除细胞的死亡率更低，进一步说明ATF4是LOP诱发自噬性死亡所必需的。
那么ATF4作为一个转录因子，是否通过其转录调控作用促进LOP诱导的自噬？作者通过RT-PCR检测ATF4下游靶基因的转录水平。LOP处理后，野生型细胞中ATG13、WIPI1、LC3、GABARAP的mRNA转录水平显著上调；在ATF4敲除之后，上述四种mRNA转录水平显著降低。由此可以说明ATF4是通过转录调控其下游自噬相关因子来促进LOP诱导的自噬的。以上结果表明，ATF4在LOP诱导的自噬以及细胞自噬性死亡中发挥着重要的作用。
（3）LOP处理诱导溶酶体内ER的降解
内质网应激会刺激内质网膜的扩张，来确保蛋白质的适当折叠。而为了维持细胞稳态，过量的内质网膜需要通过内质网自噬来降解。考虑到LOP可以诱发内质网应激，其是否也会引发内质网自噬也值得进一步探讨。KDEL序列，这是一种内质网滞留蛋白序列，带有这种序列的蛋白质在离开了内质网后，一般又会被送回到内质网中。于是作者构建了RFP-GFP-KDEL融合蛋白，在普通情况下发*光荧光。当发生内质网自噬后，部分双荧光标签的KDEL融合蛋白被转运至溶酶体。在溶酶体内酸性条件下，GFP荧光迅速猝灭，只留下红色荧光。因此，可以通过荧光显微镜测量红色斑点的数量来确定内质网自噬通量。通过采用BESS饥饿处理作为阳性对照，ATG7KO细胞作为阴性对照，可以看到LOP处理的野生型细胞中红色斑点数跟空白对照相比明显增加，由此说明LOP诱发了内质网自噬的发生。
通常来说内质网按照其表面是否含有核糖体，分为粗面内质网和滑面内质网两种。粗面内质网常呈扁平囊状，而滑面内质网则多为分支管状或小泡状。那么LOP诱发的内质网自噬发生在哪里？CKAP4，细胞骨架相关蛋白4，它是内质网囊状结构的标记蛋白。REEP5，受体辅助蛋白5，它是内质网分支管腔的标记蛋白。从C图可以看到，通过比较LOP处理后两种蛋白含量的变化，与ATG7KO细胞相比，在长时间暴露于LOP的野生型细胞中，这两种ER蛋白的表达水平均有降低，而CKAP4表现的稍显剧烈。初步说明LOP诱发的内质网自噬主要可能发生在扁平囊状区。
作者通过confocal实验进一步验证其观点。从CKAP4和LAMP1的荧光图可以看到，LOP处理后溶酶体（即图中绿色空泡）中CKAP4（即图中红色斑点）含量较空白对照组明显增多；作为阴性对照，在ATG5敲除的细胞中，自噬无法进行，因此无论饥饿处理还是LOP诱导处理其溶酶体中红色斑点数不会改变。这些结果表明粗面内质网发生了LOP诱导的内质网自噬。
而在LOP处理后，在溶酶体中REEP5较空白对照的斑点变化并不明显，表明滑面内质网基本没有发生了LOP诱导的内质网自噬。
综上所述，LOP诱发的内质网自噬主要发生在内质网的扁平囊状区。
（4）LOP触发了内质网的超微结构特征
为了进一步证实LOP诱发的内质网自噬，作者对LOP处理的细胞进行了电镜观察。AD图对比可以发现，LOP处理的细胞中，包括自噬体和自噬溶酶体在内的降解室的形成增加。BC和EF图是AD的放大图，在E、F图中我们可以看到粗糙的带有核糖体的粗面内质网。右边的统计图显示，LOP处理后有约70%的降解室中发现有内质网。因此，进一步证实LOP诱导了一种内质网自噬，其主要发生在内质网的扁平囊状区。
（5）LOP诱导网状吞噬细胞受体TEX和RETREG1的表达和降解
内质网自噬的发生需要借助内质网自噬受体的介导，接着作者进一步研究哪种受体介导了LOP诱导的内质网自噬？通过观察了几种已知的内质网自噬受体的mRNA水平，发现在LOP处理后，RTN3和SEC62水平基本未受影响，而TEX、RETREG1及CCPG1均有明显上调，说明这三者可能介导了LOP诱导的内质网自噬。而选择性自噬受体除了会被转录因子刺激上调外，还会随着货物一起被选择性的降解，那么最后将导致其蛋白表达水平降低。
作者检测了在LOP处理后这些基因的蛋白表达水平。研究发现在野生型细胞中，LOP处理导致TEX和RETREG1蛋白水平较ATG7敲除细胞显著下降，RTN3L、CCPG1和SEC62蛋白水平没有显著降低，这说明这些受体没有被LOP诱导的内质网自噬降解。这些结果表明TEX和RETREG1两种受体与LOP诱导的内质网自噬相关。
（6）LOP刺激TEX在LC3B阳性位点聚集，然后传递到LAMP1阳性溶酶体
为了进一步探讨TEX在LOP诱导内质网自噬中的作用，于是作者研究了TEX在小鼠胚胎成纤维细胞中的定位情况。在LOP处理16小时后，与对照细胞相比，TEX与LC3B存在多个显著共定位。LOP处理后，在LAMP1阳性溶酶体中TEX斑点数比空白对照明显增多。这些结果表明LOP可以促进TEX向LC3B聚集，及转运至溶酶体中。
（7）RETREG1促进LOP诱导的细胞死亡和内质网自噬
最近的研究表明，内质网自噬受体以依赖环境（context-dependent）的方式促进细胞自噬性死亡，那么LOP诱导的细胞自噬性死亡也一样？作者构建了RETREG1、TEX及RETREG1；TEXKO细胞系。TEX敲除后少量地减少了细胞死亡，而RETREG1表达缺失或RETREG1;TEXKO显著地降低了LOP诱导的细胞死亡，表明RETREG1确实促进了LOP诱导的细胞死亡。
接下来，作者研究了LOP触发的内质网自噬是否主要通过RETREG1和TEX介导。为此，作者生成了RETREG1、TEX和RETREG1;TEXKO并稳定表达内质网滞留蛋白ssRFP-GFP-KDEL细胞系。研究发现，基因敲除后的细胞较野生型细胞中红色斑点的数量明显减少，说明其自噬通量减少；与之前的研究结果一致，与TEX相比，RETREG1KO后更有效地抑制内质网自噬通量。这些数据表明RETREG1很可能是LOP触发的内质网自噬和细胞死亡的主要执行者。
（8）LOP触发的内质网自噬依赖于ATF4
LOP可以导致内质网应激和内质网自噬，而ATF4在LOP诱导的内质网应激和自噬性死亡中发挥着重要作用。那么ATF4是否同样在LOP诱导的内质网自噬的执行中发挥作用？采用双荧光标签的KDEL蛋白作为指示剂发现，与野生型相比，在LOP处理后的ATF4KO细胞中，细胞的红色荧光斑点数明显减少，说明ATF4敲除之后内质网自噬减少，这初步表明LOP诱发的内质网自噬需要ATF4。
作者进一步分析ATF4对于TEX和RETREG1的影响。通过检测mRNA转录水平，发现在LOP处理下，ATF4敲除后会明显降低其转录水平，说明其转录上调是需要ATF4，这与转录因子(TRANSFAC)数据库对RETREG1启动子内ATF4结合位点基序的分析一致。即ATF4是负责转录调控RETREG1。由此可以说明LOP触发的内质网自噬是需要ATF4的。
三、总结
在野生型胶质母细胞瘤细胞中，洛哌丁胺（LOP）处理后，细胞内发生内质网应激，刺激导致ATF4表达增加，转录水平增高，激活自噬相关基因的表达；内质网膜上的内质网自噬相关受体RETREG1和TEX与LC3相互作用，促进自噬体的形成和内质网自噬的发生，当自噬发生的程度过于严重，将会导致细胞的死亡。在敲除ATF4的胶质母细胞瘤中，LOP诱发内质网应激依旧发生，但由于ATF4蛋白敲除导致自噬相关基因表达减少，内质网自噬受体RETREG1及TEX的表达降低，内质网自噬发生受阻，从而使细胞死亡减少。研究还发现，洛哌丁胺只能诱导自噬，而不能诱导其他细胞(如小鼠胚胎成纤维细胞)的细胞死亡。一般使用洛哌丁胺作为治疗腹泻的药物时，会与肠道内的特异性结合位点结合，不会被肠道吸收，因此是无害的。
四、行文思路理解
LOP可以诱发胶质母细胞瘤自噬性死亡，而自噬性死亡之前存在内质网应激水平升高，作者想了解LOP诱导的自噬性死亡是否也存在内质网应激。于是检测了内质网应激标记蛋白。结果发现ATF4的响应早于自噬发生，且ATF4对于自噬的发生起着重要的意义。通过双荧光的内质网滞留蛋白确定存在内质网自噬，并用电镜验证了自噬发生的主要位置是粗面内质网，即扁平囊状区。随后确定了参与LOP介导诱导的内质网自噬的受体是TEX和RETREG1。而后发现TEX和RETREG1对于LOP诱导的内质网自噬和细胞死亡很重要，最后发现ATF4可以调控TEX和RETREG1，ATF4对于LOP诱发的内质网应激和内质网自噬都很重要，综上说明了ATF4将LOP诱发的内质网应激和内质网自噬联系在一起。
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